Questo metodo si basa sull'uso di un agente legante specifico e di ormoni radioattivi come tracciante per misurare la concentrazione delle sostanze. Una quantità fissa di ormone radioattivo compete con l'ormone da misurare (identico a quello radioattivo) per un numero limitato (saturato) di siti di legame di un agente legante, come gli anticorpi, ad alta affinità e specificità per l'ormone da misurare. Gli antigeni marcati liberi e quelli legati all'anticorpo devono quindi essere separati mediante centrifugazione e/o decantazione, prima di misurare la radioattività dei radioisotopi legati. La concentrazione di antigene nei campioni testati è inversamente proporzionale alla quantità di radioattività nella frazione legata.

Alcuni test ormonali utilizzano due anticorpi, uno legato alla fase solida e l'altro marcato con una sostanza segnaletica, di cui la più utilizzata è l'1125, che si legano all'ormone in esame. Questo test non competitivo e direttamente proporzionale è noto come immunoradiometrico (IRMA).

La concentrazione di un determinato ormone può essere determinata in campioni di fluidi o estratti biologici (ad esempio, siero, plasma, saliva, feci, urina, peli, ecc.).

I vantaggi della dosaggio mediante RIE risiedono nell'elevata sensibilità nel rilevare antigeni in concentrazioni molto basse, dell'ordine dei picomolari o inferiori. La maggior parte dei kit diagnostici commerciali disponibili sul mercato è stata sviluppata per la valutazione quantitativa degli ormoni nel siero umano; è quindi necessaria la validazione di questi kit ad alta specificità per l'uso in ambito veterinario, così come per qualsiasi altro test immunologico che utilizzi anticorpi sviluppati per la dosaggio nella specie umana.

Il RIE utilizza il radioisotopo ¹²⁵I, per il quale è necessaria una licenza speciale rilasciata dalla Commissione Nazionale per l'Energia Nucleare (CNEN), l'ente regolatore. Sono inoltre necessarie strutture adeguate per la sua manipolazione e lo smaltimento.

Il metodo della chemiluminescenza si basa su un fenomeno attraverso il quale si ottiene energia luminosa da una reazione chimica. Questo test immunologico utilizza un sistema basato su unità di test, rivestite con un anticorpo specifico, come test in fase solida, che fungono da recipiente per la reazione immunologica, l’incubazione, il lavaggio e lo sviluppo del segnale luminoso. L'emissione di luce del substrato chemiluminescente che reagisce con il coniugato enzimatico è proporzionale alla quantità di sostanze da analizzare. Esistono tuttavia casi in cui l'analisi viene effettuata in modo indiretto, ovvero l'analita partecipa alla generazione o al consumo della reazione chimica.

Questa tecnica presenta il vantaggio di essere semplice da eseguire e di garantire una minore variazione durante il pipettaggio, poiché il tecnico deve solo versare il campione nelle provette, mentre gli altri reagenti vengono aggiunti automaticamente dall'apparecchiatura.

Nell'attuale contesto, si tratta di uno dei settori in cui si registra un forte investimento da parte delle aziende nel mercato della medicina umana, con ripercussioni positive anche sul nostro settore di attività; possiamo quindi dedurre che ne traiamo vantaggio a nostra volta.

È importante sottolineare che esistono differenze in termini di valori e prestazioni tra apparecchiature come le più diffuse Immulite®1000 e Immulite®2000, oltre ad altre marche; è quindi necessario comunicare al medico esattamente quale modello e quale marca siano in uso nel laboratorio che sta generando tali risultati.

La spettrometria di massa (MS) si basa sul rilevamento e sulla differenziazione degli analiti attraverso le masse caratteristiche di ciascun composto o classe di composti. A tal fine, la MS converte le molecole bersaglio in ioni in fase gassosa tramite l'applicazione di una carica elettrica. Il flusso risultante di ioni caricati elettricamente viene convertito in una corrente elettrica proporzionale. La corrente viene quindi elaborata da un sistema di dati che converte le informazioni, visualizzandole come uno spettro di massa. Recentemente, questa tecnica è stata sempre più sviluppata nell'applicazione di analisi di steroidi, tiroidei, vitamine, metabolomica, tra gli altri, sia per esami di routine che in progetti di ricerca. L'LC-MS/MS è anche la tecnica analitica di scelta per la valutazione di laboratorio delle catecolamine urinarie e plasmatiche.

Quando combinata con i meccanismi di separazione fisica dell'HPLC (cromatografia liquida ad alta prestazione), la spettrometria di massa assume l'acronimo di LC-MS. L'utilizzo di questo insieme di tecnologie consente analisi ad alta specificità e sensibilità. Il vantaggio distintivo di questi metodi combinati è quello di determinare l'"identità digitale" dell'analita per ogni endocrinopatia che colpisce cani e gatti. Tra i principali vantaggi di questo metodo si evidenziano l'utilizzo di un piccolo volume di campione, la possibilità di misurare ormoni a concentrazioni relativamente basse e l'uso di una libreria di standard che consente la misurazione simultanea di diversi analiti.

Il PMI è un test diagnostico immunologico con microparticelle paramagnetiche che utilizza sfere magnetiche come marcatori al posto degli enzimi convenzionali (ELISA), dei radioisotopi (RIA) o delle molecole fluorescenti (test immunologici fluorescenti) per rilevare un analita specifico. Il PMI prevede il legame specifico di un anticorpo al proprio antigene, dove un marcatore magnetico è coniugato a un elemento della coppia. La presenza delle sfere magnetiche viene quindi rilevata da un lettore magnetico che misura la variazione del campo magnetico indotta da tali sfere. Il segnale misurato è direttamente proporzionale alla concentrazione della sostanza bersaglio che vogliamo quantificare. Le sfere magnetiche sono costituite da particelle di ossido di ferro di dimensioni nanometriche incapsulate o legate insieme a polimeri. I marcatori magnetici presentano diverse caratteristiche molto importanti, tra cui il fatto che la torbidità o la colorazione del campione non hanno alcun impatto sulle proprietà magnetiche. Un'altra caratteristica importante è che questo test non subisce interferenze da parte della biotina nella misurazione degli analiti target.

Gli enzimi sono attualmente i marcatori più utilizzati; è proprio grazie a questo metodo che disponiamo di un’ampia offerta di kit commerciali con una vasta libreria di anticorpi specifici per molte specie animali, in particolare cani, bovini e roditori (animali da laboratorio). Grazie alla possibilità di amplificazione catalitica e all'associazione con altri marcatori, ad esempio quelli chemiluminescenti e fluorescenti, si ottengono test con un basso limite di rilevabilità.

Questo sistema di analisi può funzionare sia in versione competitiva che non competitiva. Nella versione competitiva, gli antigeni marcati con enzimi competono con gli antigeni liberi (analita) per un numero limitato di anticorpi immobilizzati. Attualmente, sia per i test competitivi che per quelli non competitivi, si utilizzano sistemi che, oltre alla lettura automatizzata dei diversi pozzetti, effettuano diluizioni in serie e repliche dei campioni.