Este método se basa en el uso de un agente de unión específico y de hormonas radiactivas como marcadores para medir la concentración de sustancias. Una cantidad fija de hormona radiactiva compite con la hormona que se va a medir (idéntica a la radiactiva) por un número limitado (saturado) de sitios de unión de un agente de unión, como los anticuerpos, de alta afinidad y especificidad por la hormona que se va a medir. Los antígenos marcados libres y los unidos al anticuerpo deben, a continuación, separarse mediante centrifugación y/o decantación, antes de medir la radiactividad de los radioisótopos unidos. La concentración de antígeno en las muestras analizadas es inversamente proporcional a la cantidad de radiactividad en la fracción unida.

Algunos ensayos hormonales utilizan dos anticuerpos, uno unido a la fase sólida y el otro marcado con alguna sustancia generadora de señal —siendo el más utilizado el 1125—, los cuales se unen a la hormona objeto de estudio. Este ensayo no competitivo y directamente proporcional se conoce como inmunorradiométrico (IRMA).

La concentración de una determinada hormona puede determinarse en muestras de fluidos o extractos biológicos (por ejemplo, suero, plasma, saliva, heces, orina, pelo, entre otros).

Las ventajas de realizar el análisis mediante RIE son su alta sensibilidad para detectar antígenos en concentraciones muy bajas, del orden de picomolar o inferiores. La mayoría de los kits de diagnóstico disponibles en el mercado se han desarrollado para la evaluación cuantitativa de hormonas en el suero humano, por lo que es necesario validar estos kits de alta especificidad para su uso en veterinaria, al igual que cualquier otro inmunoensayo que utilice anticuerpos desarrollados para el análisis en humanos.

El RIE utiliza el radioisótopo ¹²⁵, para el cual se requiere una licencia especial de la Comisión Nacional de Energía Nuclear (CNEN), el organismo regulador. También se necesitan instalaciones adecuadas para su manipulación y eliminación.

El método de quimioluminiscencia se basa en un fenómeno mediante el cual se obtiene energía luminosa a partir de una reacción química. Este inmunoensayo utiliza un sistema basado en unidades de prueba, recubiertas con un anticuerpo específico, como ensayo en fase sólida, que sirve de recipiente para la reacción inmunológica, la incubación, el lavado y el desarrollo de la señal luminosa. La emisión de luz del sustrato quimioluminiscente al reaccionar con el conjugado enzimático es proporcional a la cantidad de sustancias que se van a analizar. Sin embargo, hay casos en los que el análisis se realiza de forma indirecta, es decir, el analito participa en la generación o el consumo de la reacción química.

Esta técnica tiene como ventajas su facilidad de ejecución y una menor variabilidad durante el pipeteo, ya que el técnico solo tiene que introducir la muestra en los tubos, mientras que el equipo se encarga de añadir el resto de reactivos.

En el contexto actual, se trata de uno de los métodos en los que observamos una elevada inversión por parte de las empresas en el mercado dedicado a la medicina humana, lo que también se refleja en nuestro ámbito de actuación, por lo que podemos deducir que nos beneficiamos de ello de forma paralela.

Es importante destacar que existen diferencias en cuanto a valores y rendimiento entre equipos como los más utilizados, el Immulite®1000 y el Immulite®2000, entre otras marcas, por lo que es necesario informar al médico exactamente qué modelo y fabricante se utiliza en el laboratorio que está generando esos resultados.

La espectrometría de masas (MS) se basa en la detección y diferenciación de analitos a través de las masas características de cada compuesto o clase de compuestos. Para ello, la MS convierte las moléculas objetivo en iones en fase gaseosa mediante la transmisión de una carga eléctrica. El flujo resultante de iones con carga eléctrica se convierte en una corriente eléctrica proporcional. A continuación, la corriente es procesada por un sistema de datos que convierte la información y la muestra en forma de espectro de masas. Recientemente, esta técnica se ha desarrollado cada vez más en el análisis de esteroides, hormonas tiroideas, vitaminas y metabolómica, entre otros, tanto para exámenes de rutina como para proyectos de investigación. La LC-MS/MS es también la técnica analítica de elección para la evaluación en laboratorio de las catecolaminas en orina y plasma.

Cuando se combina con los mecanismos de separación física de la HPLC (cromatografía líquida de alta resolución), la espectrometría de masas pasa a denominarse LC-MS. El uso de este conjunto de tecnologías permite realizar análisis de alta especificidad y sensibilidad. La ventaja de estos métodos combinados es que permiten determinar la «identidad digital» del analito para cada endocrinopatía que afecta a perros y gatos. Entre las principales ventajas de este método destacan el uso de un pequeño volumen de muestra, la posibilidad de medir hormonas en concentraciones relativamente bajas y el uso de una biblioteca de patrones que permite la medición simultánea de varios analitos.

El PMI es un inmunoensayo diagnóstico con micropartículas paramagnéticas que utiliza esferas magnéticas como marcador en lugar de enzimas convencionales (ELISA), radioisótopos (RIA) o moléculas fluorescentes (inmunoensayos fluorescentes) para detectar un analito específico. El PMI implica la unión específica de un anticuerpo a su antígeno, donde una etiqueta magnética se conjuga con un elemento del par. A continuación, un lector magnético detecta la presencia de las esferas magnéticas midiendo la alteración del campo magnético inducida por estas. La señal medida es directamente proporcional a la concentración de la sustancia objetivo que queremos cuantificar. Las esferas magnéticas están compuestas por partículas de óxido de hierro de tamaño nanométrico encapsuladas o unidas mediante polímeros. Las etiquetas magnéticas presentan varias características muy importantes; entre ellas, la turbidez o la coloración de la muestra no tienen ningún impacto en las propiedades magnéticas. Otra característica importante es que este ensayo no sufre interferencias de la biotina en la medición de los analitos objetivo.

Las enzimas son los marcadores más utilizados en la actualidad; sin duda, es gracias a este método que encontramos una amplia oferta de kits comerciales con una extensa biblioteca de anticuerpos, específicos para muchas especies animales, principalmente perros, bovinos y roedores (animales de laboratorio). Gracias a la posibilidad de la amplificación catalítica y a la combinación con otros marcadores, por ejemplo, los quimioluminiscentes y los fluorescentes, se obtienen ensayos con un límite de detección bajo.

Este sistema de análisis puede funcionar tanto en versión competitiva como no competitiva. En la versión competitiva, los antígenos marcados con enzimas compiten con los antígenos libres (analito) por un número limitado de anticuerpos inmovilizados. En la actualidad, tanto para los ensayos competitivos como para los no competitivos se utilizan sistemas que, además de la lectura automatizada de los diferentes pocillos, realizan diluciones en serie y réplicas de las muestras.